Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является эффективным и относительно недорогим способом копирования или «амплификации» небольших сегментов ДНК или РНК.
Используя ПЦР, миллионы копий участка молекулы ДНК синтезируются всего за несколько часов, что дает достаточное ее количество, необходимое для анализа. Этот простой метод позволяет диагностировать и контролировать заболевания с использованием минимального количества образца, такого как кровь или ткань.
Что такое ПЦР?
Хотя ПЦР происходит in vitro или вне тела в лаборатории, он основан на естественном процессе репликации ДНК. В простейшей форме реакция происходит, когда образец ДНК, ДНК-полимераза, нуклеотиды, праймеры и другие реагенты добавляются в пробирку для образцов. Реагенты облегчают реакцию, необходимую для копирования кода ДНК.
В дополнение к обнаружению заболеваний в образце, ПЦР позволяет контролировать количество присутствующего вируса или вирусную нагрузку в организме человека. При таких заболеваниях, как заражение вирусом гепатита C или вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусная нагрузка является показателем того, на какой стадии находится заболевание или насколько хорошо работает методика лечения пациента. Вооруженные этой информацией, врачи могут определить, когда начать лечение и реакцию на него, а также делая лечение индивидуальным для каждого пациента. Для проведения полимеразной цепной реакции используются специальные приборы - или термоциклеры.
В каждом цикле ПЦР есть три шага. Каждый цикл приблизительно удваивает количество ДНК-мишени. Это экспоненциальная реакция, поэтому более одного миллиарда копий исходной или «целевой» ДНК генерируются за 30-40 циклов ПЦР.
Перед началом ПЦР ДНК должна быть выделена из образца. Выделение ДНК представляет собой многоступенчатый процесс, который может быть выполнен вручную или с помощью специального оборудования. На первом этапе ПЦР, называемом денатурацией, пробирка, содержащая образец, нагревается более чем до 90 градусов по Цельсию. Высокая температура нарушает относительно слабые связи между нуклеотидами, которые образуют ДНК и молекула разделяется на две цепи. ПЦР не копирует всю ДНК в образце. Он копирует только очень специфическую последовательность кода, комплиментарную праймерам. Например, Chlamydia имеет уникальную структуру нуклеотидов, специфичных для бактерий. ПЦР будет копировать только специфические последовательности ДНК, которые присутствуют в хламидии и отсутствовать у других бактериальных видов. Для этого в ПЦР используют праймеры - короткие фрагменты синтетической ДНК, которые связывают или отжигают только последовательности по обе стороны от области ДНК-мишени. Два праймера используются на этапе два-один для каждой из отделенных одноцепочечных ДНК. Праймеры связываются с началом последовательности, которая будет скопирована, маркируя последовательность для третьего шага. На втором этапе пробирка охлаждается, а связывание с основой происходит между 40 и 60 градусами Цельсия. Шаг два дает две отдельные нити ДНК с последовательностями, отмеченными праймерами. Эти две нити готовы к копированию.
В третьей фазе реакции, называемой элонгацией, температура повышается примерно до 72 градусов по Цельсию. Начиная с областей, отмеченных праймерами, нуклеотиды в растворе добавляют к отожженным праймерам ДНК-полимеразой для создания новой цепи ДНК, комплементарной каждой из одиночных нитей матрицы. После завершения две идентичные копии оригинальной молекулы ДНК остаются в реакционной смеси.
После создания двух копий цикл ПЦР начинается снова, на этот раз с использованием новой дублированной ДНК. Каждый дубликат создает две новые копии и после приблизительно 30 или 40 циклов получается более одного миллиарда копий исходного сегмента ДНК. Поскольку процесс ПЦР автоматизирован, его можно провести всего за несколько часов.
В клинической диагностике полимеразная цепная реакция позволяет получить достаточное для проведения анализов количество копий ДНК-мишени. Их резултаты используются врачами для назначения и контроля лечения пациента. Высокая точность и относительно небольшая стоимость делает ПЦР одним из самых распространенных методов диагностики по всему миру.
По материалам сайта